如何检测狗的狂犬病毒?

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狂犬病毒和一般病毒一样,可以在宿主动物的唾液中,以及它直接接触的伤口或粘膜上进入机体,进而大量繁殖,通过损伤的粘膜或血管的血液,而传播到全身。狂犬病毒主要是通过疫区的狗,及其他肉食动物的唾液,而传染给人。

狂犬病毒不耐高温,在55~100℃,经过5~30分钟时间即可杀死病毒;对酸和碱的抵抗力很强,在pH缓冲浓度为0.1当量的柠檬酸溶液中或pH值为4.5的盐水里,就能耐受1000小时。对一氧化碳和光,也有些抵抗性。

1993年11月,巴西里约热内卢大学卫生学家S.C.奥尔蒂斯发现,狂犬病毒在狗的肠黏膜上,能生长繁殖,并通过唾液排出体外,通过人的口鼻,又回到人体体内。这种能在不同食团之间,在狗的肠道和人的口腔粘膜上,短暂存活的狂犬病毒,成为新的狂犬病毒载体。肠道病毒载体,可让人被动感染狂犬病毒,无需通过受外伤出血的途径。这种病毒载体的发现,为狂犬病的控制带来了新的希望。

检测狂犬病毒的方法

1、 血清学诊断方法

(1) 间接免疫荧光抗体试验 (IFAT):以狂犬病毒对应抗原,制成1:50(含50%阳性血球)或1:250(含25%阳性血球)的免疫血清,染色于冰冻撕碎组织1小时,冲洗后显微镜下检查,可见抗原与抗体结合的黄褐色荧光着色。此法特异高、方法简单,对判断发病或潜伏期的长短及临床诊疗均有辅助意义。

(2) 补体结合试验(CFT):以狂犬疫区健康动物血清或兔血清,与狂犬病毒抗原配合,于37℃水浴60分钟,分离抗生素处理豚鼠红细胞,以生理盐水洗涤两次,稀释至1%比例,即得正常血清,以该血清作10倍比稀释于4℃下的微量溶血试验,在545nm处测定吸光度(A)以判断血清防治狂犬病的效果。该法灵敏简便,结果迅速,假阳性率低,适用于大规模狂犬病免疫效果监测。

(3) 酶联免疫吸附试验(ELIS):以纯化狂犬病毒抗原,包被于聚苯乙烯板孔内,PBS(pH7.2)洗去多余抗原,之后加正常或患者血清、脑血浆、骨髓等,37℃下与酶标记狂犬病毒抗原结合1小时,洗去未结合的酶,暴露设对应的底物,显色以判定阳性。该法特异高,对5~100型狂犬病毒均有很高的灵敏度和特异性的检测,可鉴别出血清学和分子生物学检测不到的病毒荷量,适用于流行病学调查和临床早期诊断。

(4) 反相交叉ELISA (RCE):该法是在常规ELISA的基础上,改进酶标二抗与一抗结合后的洗涤方法,使酶标二抗和一抗正确的结合而不分离,该法较常规酶联免疫吸附试验(ELISA)灵敏度更高一步,可测定10-5~10-7g病毒/L量。

(5) 免疫层析试验(DCA):原理类似于胶体金免疫层析技术,以微孔滤膜为固相载体,包被狂犬病毒抗原,预先用经狂犬病毒NRV182S株免疫的家兔,制备特异性抗体,与可疑病人血清或脑脊液分离,立即在微孔中产生免疫渗滤作用,膜反面显色,通过观察吸光度值,判定结果。该法是测定极微量狂犬病毒荷量,间接检测感染者是否带有狂犬病毒抗原,为急性感染狂犬病的早期诊断提供依据。

2、病原学检测方法

(1) 病毒分离:以消毒伤口剪取表皮,或咬肌真皮及边缘组织,或抽吸脓液作荧光抗体印迹法(FAT)或免疫组织化学染色法(IHC)检查。

(2) 核酸检测:以TRIZOL法提取病毒基因组DNA,也可分别以小鼠和Hep-2细胞感受狂犬病毒,以Trypticase Soy贝氏液(BHT)抽提接种细胞后的细胞病变(CPE),以DNA探针,于核酸分子杂交仪上检测病毒的核酸。该法在3~6小时内可判断结果。

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